技术。这个当年名声大噪的技术，现今依旧热度不减，尤其是我们的CRISPR大神张锋，近期发表的文章频频亮相于知名杂志，又引起一片热议。时过境迁，CRISPR技术并没有销声匿迹，一直在线。但任何事物包括技术

　　火了四年之久的技术，耳熟能详的优势显而易见：摒弃了对于ES细胞的依赖，CRISPR技术实现了对大鼠、猪、猴、斑马鱼等多种物种的编辑；CRISPR技术依赖于Cas9和sgRNA实现“精准”切割，简化实验步骤，大大缩短实验周期。周期短、工作量小，随之而来的就是费用的降低。综上，性价比高的技术当然当仁不让的会一直火。

　　CRISPR技术自问世以来，被应用至世界各地众多实验室中进行科学研究，在享受其优势的同时，它的弊端也是众所周知：sgRNA与Cas9蛋白这哥俩，并不是时时刻刻都兢兢业业工作的，谁还没有倦怠的时候呢？本应该精准定位的sgRNA也有走眼的时候，本应该识别标准PAM序列 的Cas9蛋白，也偶尔不走心，结果就是脱靶，影响了编辑的效率。

　　医生治病讲究对症下药，科研思路也不例外。找出原因解决问题，既然是sgRNA和Cas9蛋白出现了毛病，那么我们就针对不同病症采取不同方式：

　　（1）改变自我：改变sgRNA 的长度，截断5 端的2-3 个碱基或在识别序列前加2 个鸟嘌呤，切割活性不变， 脱靶率降低5000 倍。

　　（2）提升自我：增加sgRNA 的稳定性。如在gRNA 中增加一对A-U 碱基配对等方法。此外， 有研究表明Cas9 直系同源酶对某些位点的特异性较SpCas9 高，这无疑为提高特异性提供了一条新思路。

　　专一性对于家庭是很重要，而对于CRISPR技术也是很重要。专一性一方面与自身有关，另一方面也与环境的诱惑有关，因此对于Cas9蛋白，我们要从内和外两个因素去考虑。

　　（1） 擦亮眼睛，辨认出谁是你的Mr/Mrs Right：增强Cas9 蛋白对标准PAM 序列的识别能力，突变体D1135E对标准PAM 的识别更加特异，从而降低因识别非标准PAM 序列而引起脱靶。

　　（2）与对的人相亲相爱就好，不要老是沾花惹草：将Cas9蛋白进行定点突变形成eSpCas9和SpCas9-HF1，突变体减弱了Cas9 蛋白与DNA 的非特异性结合的能力，增强靶向序列与Cas9 蛋白结合的竞争力。

　　（3）减少外界诱惑：调控Cas9 蛋白在细胞中的表达量。通过使用诱导型启动子、插入4-HT 依赖的内含肽等方法构建诱导型Cas9 蛋白，减少基因组暴露于Cas9 与sgRNA 复合体的时间， 即减少Cas9 与非靶向序列的结合概率，进而降低脱靶率。

　　（4）断舍离：仅保留其核酸识别能力，断除其核酸内切酶的活性。当然对于自身也是必须的：降低HNH 或RuvC 结构域功能的突变体H840A 和D10A；构建使Cas9 蛋白丧失核酸内切酶活性，借助其他核酸内切酶实现基因编辑的CRISPRi和FokⅠ-dCas9。

　　对大量数据统计数据分析发现，采用ES细胞方式制备，随机插入概率约为20%，采用CRISPR/Cas9技术，大约有32%的概率有随机插入。而这32%中有14%的随机插入无法依靠交配传代去除，排除随机插入的金标准是Southern blot。百奥赛图严把质量关，坚持进行Southern blot检测，确保基因编辑获得的动物无随机插入。

　　Southern杂交的目的是为了检测目的基因的插入位置及拷贝数量。Southern blot杂交是进行基因组DNA特定序列定位的方法，其操作过程：利用电泳分离经酶消化后的DNA片段，然后再将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

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